兔抗V5标签抗体亲和纯化：从低丰度到高表达的精准定量方案

一、产品概述V5标签是一种由14个氨基酸残基组成的短肽标签序列为GKPIPNPLLGLDST源自猴副流感病毒5型Simian virus 5RNA聚合酶α亚基。作为一种表位标签V5标签具有分子量小约1.4 kDa、免疫原性低、不易干扰融合蛋白天然构象和功能的优点广泛应用于重组蛋白的检测、纯化及定位研究。与其它常用标签如FLAG、HA、c-Myc相比V5标签尤其适合用于需要维持蛋白天然活性的实验体系。本文介绍艾美捷代理Bethyl Laboratories推出的兔抗V5标签抗体亲和纯化货号A190-120A适用于酶联免疫吸附测定ELISA、免疫细胞化学ICC、免疫沉淀IP及免疫印迹WB等多种检测平台。二、核心规格参数参数 | 详细信息靶标 | V5标签GKPIPNPLLGLDST应用 | ELISA, ICC, IP, WB宿主 | 兔克隆性 | 多克隆形式 | 全IgG同型 | IgG标记 | 非偶联纯度 | 抗原亲和纯化浓度 | 1 mg/ml储存条件 | 2 - 8 °C保质期 | 收货后1年缓冲液 | 磷酸盐缓冲液PBS含0.09%叠氮化钠三、免疫原与生产工艺免疫原设计本抗体采用合成肽作为免疫原。该合成肽对应V5标签的全长氨基酸序列即猴副流感病毒5型RNA聚合酶α亚基的第95至108位残基序列GKPIPNPLLGLDST。为提高免疫原性该合成肽与匙孔血蓝蛋白KLH进行化学交联偶联随后用于兔免疫。纯化方法抗血清经采集后通过亲和层析法纯化。将V5标签合成肽固定在固相支持物上从抗血清中特异性捕获识别V5标签的抗体经洗脱后获得高纯度、高特异性的多克隆抗体。此工艺有效去除了不识别V5标签的非特异性IgG确保抗体在各类应用中的低背景和高信噪比。浓度测定免疫球蛋白浓度采用比尔定律测定。标准条件下1 mg/mL IgG在280 nm波长处的吸光度A280为1.4。本抗体浓度为1 mg/ml。对于酶偶联物如HRP标记版本酶/抗体蛋白的摩尔比为4:1本产品为非偶联版本此信息供参考。四、应用与实验条件重要提示并非所有列出的应用均已在本实验室经过具体测试。用户需根据自身实验体系进行优化和验证。以下推荐条件基于产品说明及行业通用经验。通用说明所有免疫印迹实验均采用5%脱脂牛奶-TBST作为封闭液及抗体稀释液。一抗孵育条件为过夜孵育推荐4°C。推荐稀释比例与用量应用 | 推荐稀释比例/用量 | 说明ELISA | 1:1000 - 1:30000检测用1:100 - 1:500包板用 | 作为检测抗体时建议从1:5000开始优化作为包被抗体时用PBS稀释后包被ELISA板免疫细胞化学ICC | 1:100 - 1:400 | 建议使用4%多聚甲醛固定细胞0.1% Triton X-100透化免疫沉淀IP | 1 - 4 µg/mg 裂解物 | 具体用量取决于V5标签融合蛋白的表达水平免疫印迹WB | 1:1000 - 1:30000 | 建议从1:5000开始进行梯度预实验五、二抗选择说明细胞裂解物免疫印迹使用山羊抗兔IgG重链和轻链抗体货号A120-101P。该二抗可同时识别兔IgG的重链和轻链适用于检测总IgG信号。免疫沉淀产物的免疫印迹使用抗兔IgG轻链HRP偶联抗体并在封闭缓冲液中添加5%正常猪血清货号S100-020。采用轻链特异性二抗可有效避免免疫沉淀中抗体重链约55 kDa信号的干扰尤其当目标融合蛋白分子量接近55 kDa时尤为重要。六、产品使用与储存储存注意事项抗体应储存于2 - 8°C请勿冷冻。反复冻融会导致抗体聚集和活性下降。缓冲液为PBS含0.09%叠氮化钠作为防腐剂。稳定性与保质期自收货之日起在推荐的储存条件下保质期为1年。建议分装为单次使用量储存于2-8°C避免反复开盖引入污染。七、V5标签的技术优势V5标签14个氨基酸GKPIPNPLLGLDST具有以下特点使其成为蛋白检测的优选标签1. 分子量极小约1.4 kDa远小于GFP27 kDa或GST26 kDa对融合蛋白的天然结构、互作及生物学功能干扰极小。2. 高免疫原性该序列在哺乳动物蛋白质组中罕见抗V5抗体与非特异性蛋白的交叉反应风险低。3. 多位置兼容可融合于目标蛋白的N末端、C末端或内部环区通常不影响蛋白的折叠和活性。4. 检测灵敏度高本抗体在WB中稀释比可达1:30,000ELISA中可达1:30,000足以检测低丰度表达的重组蛋白。